moc2 خط الخلية

moc2 خط الخلية

بروتوكولات زراعة الأنسجة لمختبر أوبالاوري لخطوط الخلايا MOCتحديث 12.12.16

المواد المطلوبة (انظر بروتوكول IMDM المرفق للكواشف المطلوبة لجعل IMDM MOC خط الوسائط)

سيجما ألدريش: DMSO: D2650-100ml

FisherScientific:

T150زجاجات : 07-200-64

زجاجات T75: 10-126-37

Cryovials : 03-374-059

فلاتر 45um: 09-754-21

05٪ تريبسين: sh30236.01

25٪ تريبسين: sh30042.01

خطوط Indolent - MOC1 ، 22

خطوط عدوانية - MOC2

ذوبان خطوط الخلايا

1. إضافة 21ml IMDM MOC خط الوسائط إلى T150 قبل الذوبان (أو 10ml إلى T75 إذا كنت ترغب في الذوبان إلى aT75)

2. إزالة cryovial من النيتروجين السائل، قنينة رش مع 70٪ الكحول لتنظيفها.

3. عقد النصف السفلي من cryovial في 37Cwaterbath (دون السماح للغطاء لمس الماء، لتجنب التلوث) حتى يكون هناك قطعة صغيرة من الجليد يترك عائمة.

4. رش cryovial مرة أخرى مع ETOH ووضع في غطاء. ضغط 1 مل من الوسائط إلى 1 مل من الخلايا وإضافة هذه 2 مل إلى T150 التي تحتوي بالفعل على الوسائط (لجعل 22 مل إجمالي لT150 واحد).

5. خذ بعض الوسائط بالفعل في قاروفة T150 وشطف لوحة cryovialand هذا للتأكد من أن لديك جميع الخلايا المتبقية المتبقية في cryovial.

تجميد خطوط الخلايا:

تعمل بسرعة ، لأن DMSO سام للخلايا

لكل قنينة T150 مع تقاطع الخلايا بنسبة 70-80٪، تجميد 3-4 قنينات.

1. حصاد الخلايا من T150 كما هو مبين أدناه

2. تدور أسفل في الكريات في أنبوب مخروطي 15ml (1000 دورة في الدقيقة x5 دقيقة)

3. التخلص من الفائق

4. اضغط على 15 مل أنبوب مخروطي toresuspend الخلايا

5. إضافة 1.5 مل من IMDM MOC خط وسائل الإعلام، إعادة تشكيل الخلايا في وسائل الإعلام - الحفاظ على الجليد

6. إضافة 1.5 مل من تجميد وسائل الإعلام قطرة ببطء بينما الأنبوب على الجليد

لجعل تجميد الوسائط - 20٪ DMSO في IMDM MOC خط الوسائط. مثلًا: للمخزون 20 مل - إضافة 16 مل IMDM MOC خط الوسائط و 4 مل DMSO. فلتر حقنة باستخدام فلتر.45um

7. أليكوت 1ml كل إلى 3 cryovials

8. تخزين في -80C لمدة لا تزيد عن أسبوعين.

9. وضع في النيتروجين السائل في غضون 1-2 أسابيع.

ملاحظة: إذا أردت، قد تزيد إلى 2 مل IMDM و 2 مل تجميد الوسائط لتخزينها في 4 زجاجات. أيضا، فكرة جيدة لعد الخلايا وتسجيل على القارورة قبل تجميد الخلايا.

moc2 خط الخلية

خصائص خط الخلية:

Indolent - MOC1: أقل عدوانية بناء على دراسات in vivo. إذا مر 1: 12 من 80٪ التقاء T150، يستغرق 2-4 أيام للوصول إلى 80٪ التقاء. خطوط الخلايا MOC1 تستغرق وقتا أطول للخروج من القاروبة عند الحصاد مقارنة بخطوط الخلايا الأكثر عدوانية.

العدوانية - MOC2: أكثر عدوانية بناء على دراسات in vivo. إذا مررت 1: 12 من 80٪ التقاء

T150 ، يستغرق 2-4 أيام للوصول إلى 80٪ التقاء. خطوط الخلايا العدوانية تخرج أسهل بكثير من خطوط الكهول.

حصاد ومرور الخلايا من T150، 80٪ التقاء:

1. صب وسائل الإعلام من T150 في قنينة التفريغ

2. غسل مرة واحدة مع 10-20 مل PBS. صب غسيل PBS.

3. إضافة 1.5 مل 0.05٪ تريبسين ، قنينة الطرف للتأكد من أن تريبسين يغطي مساحة السطح بأكملها وبالتالي يلمس جميع الخلايا (قم بذلك بسرعة بحيث لا تتعرض الخلايا للتريبسين لفترة طويلة جداً) ، وإلقاء تريبسين ، ثم إعادة تطبيق 1.5 مل آخر من 0.25٪ تريبسين.

4. وضع في حاضنة 37C. حاضنة لمدة 3-4 دقائق لخطوط الخلايا العدوانية ويمكن أن تستغرق ما يصل إلى 10-12 دقيقة للكسول ولكن التحقق بعد 6-8 دقائق.

5. اضغط على جانب القابوة ضد كففة اليد متعمدة عدة مرات لتخفيف الخلايا

6. تحقق تحت المجهر لمعرفة ما إذا كانت الخلايا تطفو بحرية في وسائل الإعلام. إذا لم يكن معظمهم كذلك ، ضع مرة أخرى في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق أخرى. حاول عدم ترك الخلايا تجلس في التريبسين لفترة طويلة جدا لأن هذا سيقتل الخلايا.

7. بمجرد أن تكون جميع الخلايا أو معظمها عائمة ، أضف 10 مل من وسائط خط IMDM MOC لتحييد التفاعل.

8. وسائل الإعلام الأنابيب والخلايا من قشرة إلى 15 مل مخروطية إلى الخلايا الكريات. الطرد المركزي عند 1000 دورة في الدقيقة × 5 دقائق.

9. صب الفائق.

10. لتمرير الخلايا في 1: 12 - إعادة تعليق الخلايا في 12 مل أخرى من الوسائط.

11. خذ 1 مل من هذا ووضع في قاروفة T150 جديدة بحجم إجمالي 22 مل من وسائل الإعلام IMDM MOC خط (تخفيف 1: 12)

12. وضع مرة أخرى في حاضنة 37C للنمو. يجب أن تصل إلى 80٪ من التقاء في 2-4 أيام.

حقن في جناح الفئران (heterotopic):

تركيز الخلايا المطلوب:

MOC1، MOC22: (حقن خلايا 1e6 في 0.15ml) = 6.66e6 الخلايا / مل MOC2: (حقن خلايا 1e5 في 0.15ml) = 6.66e5 الخلايا / مل

1. حصاد الخلايا مع 0.25٪ تريبسين كما هو مذكور أعلاه.

2. بعد تحييد التريبسين مع وسائل الإعلام خط IMDM MOC ، تدور الخلية إلى حبة (1000 دورة في الدقيقة x5 دقيقة) في 50 مل مخروطي. (ملاحظة: استخدام 50 مل مخروطي للسماح إبرة قياس صغيرة رسم الخلايا ل

حقن.

3. غسل الخلايا عن طريق إعادة تعليق الكريات الخلية في 10 مل من PBS الباردة على الجليد (التأكد من إزالة أكبر قدر ممكن من الوسائط التي تحتوي على FCS) ، تدوير الخلية في الكريات مرة أخرى (1000 دورة في الدقيقة x5 دقيقة)

4. غسل الخلايا مرة أخرى عن طريق إعادة تعليق الكريات الخلية في 3-6 مل من PBS الباردة على الجليد (يتم تحديد الحجم حسب حجم الكريات ، حيث ستستخدم هذا الحجم لعد الخلايا)

5. عد cellsperml باستخدام مقياس الخلايا أو عداد الخلايا الآلي ، باستخدام تريبان الأزرق

إزالة الخلايا الميتة. باستخدام العدد الإجمالي للخلايا الموجودة (الخلايا / مل × إجمالي مل من PBS) ، حساب الحجم اللازم لتعليق حبات الخلايا لتحقيق تركيز 6.66e6 (MOC1 ، MOC22) أو 6.66e5 خلية / مل (MOC2).

على سبيل المثال ، بالنسبة لـ MOC1 ، فإن عدد الخلايا هو: 2.8e6 خلايا / مل × 5 مل (PBS) = إجمالي الخلايا 14e6. خلايا 14e6 / 6.66e6 الخلية / مل = 2.1 مل من PBS لتعليق حبات الخلية في.

6. تدور الخلايا إلى حبة مرة أخرى. صب PBS العالي (بدون استنشاق مع البيبيت). إعادة تعليق الكريات في الحجم المحسوب من الجليد البارد PBS اللازم للوصول إلى المناسب

تركيز ، مع مراعاة أنه سيكون هناك ~ 200ul متبقي في 50 مل مخروطي بعد صب العالي.

7. نقل 50 مل مخروطي في الجليد وحقن 0.15 مل (150 مل) من الخلايا لكل فأر في الجانب تحت الجلد.

8. حقن الفئران لكل بروتوكول قياسي. نستخدم حقنة 1 مل. نقوم بصياغة الخلايا باستخدام إبرة 21 مقياس 1.5 بوصة وتبديل الإبرة إلى إبرة 26 مقياس نصف بوصة للحقن.

بروتوكول لوسائط 1L