تفاعل البوليميراز المتسلسل ( PCR ) أصبحت أداة لا غنى عنها في مجال البيولوجيا الجزيئية . كشف عدة وضعت على أساس مبدأ الاسترداد ، وقد استخدم على نطاق واسع في العديد من المجالات ، مثل تشخيص الأمراض ، الممرض الكشف الوراثي ، مراقبة سلامة الأغذية ، وما إلى ذلك بسبب حساسية عالية وخصوصية عالية وسرعة وكفاءة عالية . في هذه الورقة ، مبدأ العمل ، والمكونات الأساسية ، عملية موحدة من بكر كاشف عدة سيتم تحليلها بعمق ، والتي سوف توفر المراجع المهنية بالنسبة لك لفهم هذه التكنولوجيا الرئيسية .

بكر كشف عدة ، بكر

1-1 لمحة عامة عن المبادئ الأساسية

بكر هو تقنية انتقائية تضخيم الحمض النووي شظايا محددة في المختبر . من خلال توفير نظام رد الفعل الأمثل ، والهدف من تسلسل الحمض النووي هو تضخيم أضعافا مضاعفة في غضون ساعات ( 2 ^ ن مرات يمكن أن تتولد من الناحية النظرية ن دورات ) ، وبالتالي الكشف عن الحمض النووي من عينة صغيرة جدا يمكن أن تتحقق .

1-2 آليات الاستجابة الأساسية

تبديل طبيعة : في درجة حرارة عالية ( عادة 94-95 ℃ ) ، حبلا الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل هو واحد حبلا ، كقالب التضخيم .

الصلب : رد فعل درجة الحرارة انخفضت إلى درجة حرارة محددة ملزمة التمهيدي ( عادة 50-65 ℃ ) ، المنبع والمصب التمهيدي على التوالي مع قالب الحمض النووي تسلسل التكميلية ملزمة .

الاستطالة : رواية حبلا الحمض النووي هو توليفها من dntps على طول القالب في درجة حرارة مناسبة من بوليميريز الحمض النووي ( عادة 72 ℃ ) .

هذه الخطوات الثلاث تشكل دورة واحدة ، وعادة ما تتكرر 30-40 مرات للحصول على ما يكفي من الكشف عن الحمض النووي المنتج .

تحليل المكونات الأساسية عدة

بوليميريز الحمض النووي : عادة ما تكون مقاومة للحرارة طق الانزيمات أو تعديل الإنزيمات التي تضمن البقاء على قيد الحياة في درجات حرارة عالية .

التمهيدي : استهداف محددة oligodeoxynucleotide مصممة لتحديد التضخيم خصوصية .

deoxynucleoside ثلاثي الفوسفات ( dntps ) : المواد الخام الأساسية في الحمض النووي التوليف ، بما في ذلك dtp dttp , dctp , و dgtp . . . . . . .

نظام التخزين المؤقت : توفير درجة الحموضة المناسبة ، وتركيز أيون مثبت ، وتحسين نشاط انزيم .

أيون المغنيسيوم : ضروري عامل مساعد من بوليميريز الحمض النووي ، وتركيز يؤثر بشكل مباشر على خصوصية وكفاءة التفاعل .

مسبار نظام ( qpcr كيت ) : مثل تاكمان مسبار الجزيئية بيكون ، وما إلى ذلك ، في الوقت الحقيقي الكشف عن مضان .

إجراءات التشغيل القياسية PCR كيت

2-1 التحضير قبل التجربة

عينة تجهيز :

- اختيار الأساليب المناسبة لاستخراج الحمض النووي على أساس نوع العينة ( الدم ، الأنسجة ، مسحة ، الخ . )

- الحصول على الأحماض النووية عالية الجودة باستخدام مجموعات استخراج مطابقة أو أساليب الاستخراج العام

- تحديد تركيز الحمض النووي ونقاء ( نسبة A260 / A280 ينبغي أن تتراوح بين 1.8 و 2.0 )

إعداد الكواشف والتعبئة :

- تذويب كل عنصر من عناصر مجموعة الكواشف وتخلط بلطف

- إعداد خلط السائل حسب كمية التفاعل ، والحد من الأخطاء التشغيلية

- تعمل على الجليد للحفاظ على نشاط انزيم

الوقاية من التلوث ومكافحته :

- إنشاء مناطق منفصلة : مناطق تحضير الكواشف ، ومناطق تجهيز العينات ، ومناطق تحليل التضخيم

- استخدام شفط مع فلتر عنصر لمنع تلوث الهباء الجوي

- تنظيف الجداول والأدوات بانتظام

بناء نظام رد فعل

على سبيل المثال ، 25 μ ل رد فعل النظام :

| المكونات | الحجم ( μ L ) | التركيز النهائي / الجرعة |

| 2 × بكر بريميكس | 12.5 | 1 ×

إلى الأمام التمهيدي ( 10 ميكرومتر ) | 0.5-1.0 | 0.2-0.4 ميكرومتر |

عكس الاشعال ( 10 ميكرومتر ) | 0.5-1.0 | 0.2-0.4 ميكرومتر |

| 探针 (10 ميكرومتر، qPCR) 用） | 0.5-1.0 | 0.2-0.4 μM |

| قالب الحمض النووي | 2-5 | 1-100 نانوغرام |

| ماء معقم منزوع الأيونات | يكمل إلى 25 | - |

إعداد الاحتياطات :

1 . وأخيرا ، إضافة قالب الحمض النووي لمنع التلوث

2 . بلطف يمزج جيدا ، وتجنب توليد فقاعات

3 . قصيرة الطرد المركزي جمع قطرات

وضع إجراءات الاسترداد

الإجراء التقليدي ثلاث خطوات :

1 . predenaturation : 95 ℃ ، 2-5 دقائق ( ضمان الانتهاء من quan denaturation )

2 . التعميم التضخيم ( 35-40 دورات ) :

- انحطاط : 95 درجة مئوية ، 15-30 ثانية

- الصلب : 50-65 ℃ ، 15-30 ثانية ( الأمثل وفقا TM قيمة الاشعال )

- استطالة : 72 ℃ ، 15-60 ثانية / كيلوبايت ( تعديل طول المنتج )

3 . تمديد النهائي : 72 ℃ ، 5-10 دقائق

4 . الحفاظ على : الحفاظ على 4 أو 12 درجة مئوية

إجراءات سريعة خطوتين ( بعض مجموعات مناسبة ) :

الجمع بين الصلب مع التمديد في خطوة واحدة ( عادة 60-65 ℃ ) ، وتقصير دورة الزمن .

التدرج PCR

في التجربة الأولى ، التدرج ( على سبيل المثال ، 55-65 ℃ ) يمكن وضعها في درجة حرارة التخمير لتحديد درجة الحرارة القصوى جيا الصلب .

2-4 تحليل النتائج

نقطة النهاية PCR :

- الاغاروز الكهربائي الهلامي : الحكم على موقع الفرقة وسطوع

- الشعرية الكهربائي : ارتفاع القرار والقدرة الكمية

في الوقت الحقيقي الاسترداد الكمية الفلورسنت ( qpcr ) :

- تحليل منحنى التضخيم : تحديد عدد دورات العتبة ( قيمة CT )

- تحليل منحنى ذوبان : التحقق من خصوصية المنتج

تفاعل البلمرة المتسلسل الرقمي

لا تحتاج إلى منحنى القياسية ، وحساسية عالية .

العوامل الرئيسية التي تؤثر على استراتيجية التحسين

التصميم الأمثل التمهيدي

- طول : عادة 18-25 النيوكليوتيدات

- محتوى GC : 40-60%

- TM القيمة : الفرق التمهيدي المنبع والمصب لا يتجاوز 2 درجة مئوية

- تجنب الهياكل الثانوية و ديمر التمهيدي

رد الفعل الأمثل

تركيز أيون المغنيسيوم : الأمثل عادة في نطاق 1.5-3.0 مم

درجة حرارة التلدين : 2-3 ℃ اختبار وفقا التمهيدي TM

عدد الدورات : تجنب الإفراط في الدورة الدموية مما يؤدي إلى التضخيم غير محدد

3-3 وضع الضوابط

مراقبة إيجابية : تأكيد نظام رد فعل يعمل بشكل صحيح

السيطرة السلبية

- مراقبة بدون قالب ( NTC ) : رصد تلوث الكواشف

- لا التمهيدي الضوابط : استبعاد قالب من التضخيم الذاتي

- السيطرة على عينة سلبية : تأكيد خصوصية الكشف

رابعاً - المشاكل والحلول المشتركة

| ظاهرة المشكلة | الأسباب المحتملة | الحلول |

| لا تضخيم المنتج 𞓜 قالب التدهور ، وسوء تصميم الاشعال ، رد فعل غير مناسب | فحص قالب الجودة ، وإعادة تصميم الاشعال ، وتحسين ظروف رد الفعل |

| غير محددة الشريط | انخفاض درجة حرارة التخمير ، وضعف خصوصية التمهيدي ، وارتفاع تركيز أيون المغنيسيوم | زيادة درجة حرارة التخمير ، إعادة تصميم التمهيدي ، والحد من تركيز أيون المغنيسيوم |

| التمهيدي ديمر | تركيز عالية من التمهيدي ، 3 ' محطة التكامل | انخفاض تركيز التمهيدي ، إعادة تصميم التمهيدي |

| انخفاض كفاءة التضخيم | قالب مثبطات ، وانخفاض نشاط الكواشف ، وسوء حالة رد الفعل | تنقية القالب ، واستبدال الكواشف الطازجة ، وتحسين نظام رد الفعل |

خامساً - مجالات التطبيق واتجاهات التنمية

5-1 مجالات التطبيق الرئيسية

- التشخيص السريري : الكشف عن مسببات الأمراض ، والكشف عن الأمراض الوراثية ، والكشف عن علامات الورم

- سلامة الأغذية : الكشف عن مسببات الأمراض التي تنقلها الأغذية والمكونات المعدلة وراثيا والمواد المسببة للحساسية

- الطب الشرعي : تحليل بصمات الحمض النووي والأبوة

- التكنولوجيا الحيوية الزراعية : تحديد الأصناف والكشف عن التحوير الوراثي

- التطبيقات العلمية : تحليل التعبير الجيني ، والتحقق من صحة الاستنساخ ، والكشف عن الطفرات

5-2 الاتجاهات التكنولوجية

متعددة PCR : الكشف عن أهداف متعددة في وقت واحد ، وتحسين تدفق

PCR السريع : تحسين نظام رد الفعل الأنزيمية ، وتقصير وقت الكشف

بكر الرقمية : تحقيق المطلق دوي الكمية ، وتحسين دقة الكشف

المحمولة PCR : الكشف السريع في الموقع ، ومناسبة للاستخدام في قاعدة الميدان

درجة حرارة الغرفة الاستقرار كاشف : لا تحتاج إلى سلسلة التبريد والنقل ، وتوسيع نطاق التطبيق

سادساً - توصيات بشأن الشراء والاستخدام

6-1 اختيار عدة نقاط

1 . تطبيق مطابقة : اختيار حسب الكشف عن الهدف و نوع العينة

2 - الحساسية والدقة : الرجوع إلى بيانات التحقق من الأداء

3 . سهولة التشغيل : خلط السائل يمكن تبسيط عملية

4 . التوافق : مطابقة مع الصكوك الموجودة في المختبر

5 - الدعم التقني : الخدمات التقنية والتدريب المقدم من الموردين

6-2 اعتبارات الاستخدام

1 - التقيد الصارم كيت تعليمات ، لا تغيير النظام بشكل عشوائي

2 . تجنب خلط الكواشف مع دفعات مختلفة

معايرة المعدات بانتظام لضمان دقة البيانات

4 - وضع إجراءات التشغيل الموحدة للمختبرات ( سوب )

5 - المشاركة في تقييم الخلالي ، وضمان جودة الاختبار

مثل أداة أساسية في الكشف الجزيئي ، بكر كاشف عدة علمية وعملية التوحيد تحديد موثوقية الكشف عن النتائج . مع تطور التكنولوجيا وتطبيقها ، بكر كيت هو النامية نحو حساسية عالية ، وارتفاع تدفق أسرع وأكثر ملاءمة . فهم مبدأ العمل ، إتقان عملية التشغيل القياسية ، وإيلاء الاهتمام إلى العوامل الرئيسية هي أساس الحصول على نتائج دقيقة وموثوق بها . من أجل التشخيص السريري ، والبحث العلمي ، ومراقبة الجودة ، وتوحيد استخدام PCR كيت هو أمر بالغ الأهمية .

في المستقبل ، جنبا إلى جنب مع التضخيم متساوي الحرارة ، ميكروفلويديك رقاقة الانصهار وغيرها من التكنولوجيات الجديدة ، الكشف عن الحمض النووي التكنولوجيا سوف تكون أكثر تنوعا . التحسين المستمر وتطبيق الابتكار سوف تجعل بكر الكشف أكثر قيمة في مجال الصحة البشرية ، والسلامة البيولوجية ، والبحوث العلمية .