إليسا ، إليسا

أساس اليسا هو التجمد من مستضد أو الأجسام المضادة انزيم العلامات من مستضد أو الأجسام المضادة . مستضد أو الأجسام المضادة التي تربط على سطح صلب الناقل لا تزال تحافظ على النشاط المناعي ، انزيم المسمى مستضد أو الأجسام المضادة لا تزال تحافظ على النشاط المناعي ، ولكن أيضا الحفاظ على نشاط انزيم . في الاختبار ، اختبار عينة ( اختبار الأجسام المضادة أو مستضد ) يتفاعل مع مستضد أو الأجسام المضادة على سطح صلب الناقل . مستضد الضد المعقدة على شكل صلب الناقل هو فصل من المواد الأخرى في السائل عن طريق الغسيل . الانزيم المسمى مستضد أو الأجسام المضادة هي أيضا بالإضافة إلى ذلك بالإضافة إلى ذلك بالإضافة إلى رد فعل على الناقل الصلبة . وفي الوقت نفسه ، فإن كمية الانزيم في المرحلة الصلبة في نسبة معينة مع كمية من المواد في العينة . بعد إضافة انزيم رد فعل الركيزة ، الركيزة هو المحفز من قبل الإنزيم في لون المنتج ، وكمية من المنتج هو ذات الصلة مباشرة إلى كمية من المواد التي يجري اختبارها في العينة . بسبب ارتفاع كفاءة الحفاز الانزيم ، نتيجة رد فعل مناعي هو تضخيم بشكل غير مباشر .

إليسا ، إليسا

إليسا يمكن استخدامها لتحديد المستضدات والأجسام المضادة . هناك ثلاثة الكواشف اللازمة في هذه الطريقة : ( 1 ) المرحلة الصلبة المضادات الحيوية أو الأجسام المضادة ، أي ' immunoadsorbent ' ؛ ( 2 ) انزيم المسمى مستضد أو جسم يسمى ' كونجوجاتي ' ؛ ( 3 ) انزيم رد فعل الركيزة . أنواع مختلفة من أساليب الكشف يمكن أن تكون مصممة وفقا لمصادر الكواشف ، والعينات ، وظروف الاختبار . هناك عدة أنواع رئيسية من إليسا المستخدمة في التجارب السريرية :

1 . مزدوجة ساندويتش الأجسام المضادة للكشف عن مستضد

المزدوج ساندويتش الضد هو طريقة شائعة للكشف عن مستضد زوي .

1 ) ربط الأجسام المضادة المحددة مع الناقل الصلبة لتشكيل الأجسام المضادة الصلبة . غسل لإزالة الأجسام المضادة غير الملزمة والشوائب .

2 ) إضافة عينة لفحصها ، والحفاظ على حرارة التفاعل . مستضد في العينة جنبا إلى جنب مع الأجسام المضادة الصلبة على شكل صلب مستضد الضد المعقدة . يغسل لإزالة المواد الأخرى غير الملزمة .

3 ) إضافة انزيم المسمى الأجسام المضادة ، والحفاظ على حرارة التفاعل . المستضدات في المرحلة الصلبة المجمعات المناعية ملزمة انزيم المسمى الأجسام المضادة . * غسل الأجسام المضادة غير الملزمة المسمى الانزيم . في هذه الحالة ، فإن كمية الانزيمات التي يحملها الناقل الصلبة يرتبط مع كمية المستضد في العينة .

4 ) إضافة لون الركيزة . الانزيمات في المرحلة الصلبة تحفز الركيزة إلى لون المنتج . من خلال قياس الألوان ، وكمية من المستضدات في العينة التي تم تحديدها .

في التجارب السريرية ، هذا الأسلوب هو مناسبة لاختبار المستضدات الجزيئية الكبيرة مثل HBsAg ، HBeAg ، وكالة فرانس برس ، قوات حرس السواحل الهايتية ، وهلم جرا . هذا الأسلوب يمكن أن تستخدم في تغليف الصلبة الناقل وإعداد انزيم كونجوجاتيس شريطة الحصول على الأجسام المضادة المحددة ضد مستضد . على سبيل المثال ، إذا كان مصدر الأجسام المضادة هي مصل مضاد ، طلاء انزيم المسمى الأجسام المضادة مأخوذة من أنواع مختلفة من الحيوانات ، على التوالي . على سبيل المثال ، عندما تستخدم الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ، واثنين من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة التي تستهدف مختلف محددات المستضد يتم اختيارهم ، على التوالي ، من أجل طلاء الصلبة الناقل وإعداد انزيم كونجوجاتيس . . . . . . . هذا الموقع المزدوج ساندويتش طريقة خصوصية عالية ، ويمكن أن تبقي على عينة اختبار الأجسام المضادة انزيم المسمى معا من أجل الكشف عن خطوة واحدة . في خطوة واحدة ، عندما محتوى المستضد في العينة عالية جدا ، والإفراط في مستضد مرتبط مع الأجسام المضادة الصلبة و انزيم المسمى الأجسام المضادة ، على التوالي ، بدلا من تشكيل ساندويتش المعقدة . في هذه الحالة ، امتصاص الضوء من قيمة اللون بعد رد الفعل ( على مستضد فائض الفرقة ) هو نفسه كما ان من مستوى منحنى ( على مستضد فائض الفرقة ) من تركيز مستضد ، على سبيل المثال ، إذا كانت النتائج تقاس بالطريقة العادية ، فإن النتائج ستكون أقل من المحتوى الفعلي ، هذه الظاهرة المعروفة باسم هوك تأثير ( هوك تأثير ) ، لأن المنحنى القياسي يصل إلى ذروته بعد المنحنى . عندما ربط تأثير خطير ، رد فعل يمكن أن تظهر نتائج سلبية كاذبة حتى من دون لون . ولذلك ، ينبغي إيلاء الاهتمام إلى ارتفاع قيمة زوي في قياس مجموعة من خطوة واحدة الكاشف عندما تستخدم لتحديد المواد التي يمكن أن تزيد بشكل غير طبيعي في عينة ( على سبيل المثال ، HBsAg ، وكالة فرانس برس ، قوات حرس السواحل الهايتية في البول ، الخ . ) إعداد الأجسام المضادة وحيدة النسيلة عالية تقارب هذه الكواشف يمكن أن تقلل من تأثير هوك . إذا كان عدد وافر من نفس المحددات ، مثل HBsAg ، موجودة في مواقع مختلفة من جزيء تحت الاختبار ، نفس الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ضد هذا القرار يمكن أن تكون مغلفة على التوالي في المرحلة الصلبة و إعداد انزيم كونجوجاتيس . . . . . . . ومع ذلك ، في الكشف عن HBsAg ، ينبغي إيلاء الاهتمام إلى أنواع فرعية من HBsAg . هناك أربعة أنواع فرعية من HBsAg : ADR ، ADW ، AYW ، AYR ، على الرغم من أن كل نوع فرعي له نفس التفاعل مع محددات ، وهذا هو أيضا مشكلة ملحوظة في استخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ساندويتش الأسلوب . نقطة أخرى مثيرة للاهتمام في الكشف عن مستضد الضد المزدوج ساندويتش هو تدخل عامل الروماتويد ( RF ) . الترددات اللاسلكية هو أوتوانتيبودي في الغالب نوع الغلوبولين المناعي ، والتي يمكن أن تربط إلى نادي جزء من مجموعة متنوعة من الحيوانات مفتش . إذا كان المصل يحتوي على عينة من البحث و التي يمكن استخدامها للكشف عن الأجسام المضادة ساندويتش مزدوجة ، فإنه يمكن استخدامها بوصفها مستضد عنصر ، وفي الوقت نفسه ، فإنه يمكن أن تكون جنبا إلى جنب مع الأجسام المضادة الصلبة انزيم المسمى الأجسام المضادة ، مما يدل على ردود فعل إيجابية كاذبة . . . . . . . باستخدام و ( أ ) أو القوات المسلحة البوروندية شظايا مثل انزيم كونجوجاتيس ، تدخل الترددات اللاسلكية يمكن القضاء عليها عن طريق إزالة نادي شرائح . إذا كانت الأجسام المضادة مزدوجة ساندويتش اليسا تتأثر الترددات اللاسلكية أو لا ، وقد تم تصنيف مؤشر التقييم لهذا النوع من الكواشف . المزدوج ساندويتش الضد طريقة مناسبة لتحديد المستضدات الجزيئية الكبيرة مع اثنين أو أكثر من التكافؤ ، ولكن لا يمكن استخدامها لتحديد ناشبة والجزيئات الصغيرة أحادي التكافؤ المستضدات .

2 . مزدوجة مستضد ساندويتش طريقة للكشف عن الأجسام المضادة

نمط رد الفعل هو مماثلة لتلك التي من الضد المزدوج ساندويتش الأسلوب . المغلفة مع مستضد معين وإعداد انزيم كونجوجاتيس للكشف عن الأجسام المضادة المقابلة . . . . . . . مقارنة مع الطريقة غير المباشرة ، انزيم المسمى مستضد يستخدم لتحل محل انزيم المسمى الأجسام المضادة . هذا الأسلوب لا يحتاج إلى تخفيف ، ويمكن استخدامها مباشرة في تحديد حساسية أعلى نسبيا من الطريقة غير المباشرة . هذه الطريقة غالبا ما تستخدم للكشف عن الاجسام المضادة في التهاب الكبد الوبائي ب علامات . مفتاح هذا الأسلوب هو إعداد انزيم المسمى مستضد ، وينبغي أن تجد طريقة مناسبة لوضع العلامات وفقا لمختلف مستضد هيكل .

3 - طريقة غير مباشرة لقياس الأجسام المضادة

الطريقة غير المباشرة هي طريقة شائعة للكشف عن الأجسام المضادة . المبدأ هو استخدام انزيم المسمى الأجسام المضادة ( الأجسام المضادة ضد الغلوبولين المناعي البشري ) للكشف عن الأجسام المضادة المرتبطة مستضد الصلبة ، لذلك يسمى الأسلوب غير المباشر ( انظر الشكل 2-3 ) . الخطوات العملية هي كما يلي :

1 ) ربط مستضد معين مع المرحلة الصلبة الناقل لتشكيل المرحلة الصلبة مستضد . غسل يزيل unbonded المستضدات والشوائب .

2 ) إضافة مصل مخفف لفحصها ، والحفاظ على حرارة التفاعل . الأجسام المضادة المحددة في مصل الدم جنبا إلى جنب مع المرحلة الصلبة مستضد لتشكيل المرحلة الصلبة مستضد الضد المعقدة . بعد الغسيل ، فقط الأجسام المضادة المحددة التي تركت على الناقل الصلب المرحلة ، وغيرها من المكونات في مصل الدم يتم غسلها في عملية الغسيل .

3 ) إضافة انزيم المسمى الأجسام المضادة . مجموع الأجسام المضادة التي يمكن الكشف عنها بواسطة انزيم مرتبط المناعي الأجسام المضادة البشرية ، ولكن عادة ما يتم الكشف عن الأجسام المضادة باستخدام انزيم مرتبط المناعي الأجسام المضادة البشرية . . . . . . . الأجسام المضادة في الحالة الصلبة immunocomplex ملزمة مع انزيم المسمى الأجسام المضادة ، وبالتالي بشكل غير مباشر المسمى superenzyme . . . . . . . بعد الغسيل ، كمية الانزيم على الناقل الصلب المرحلة يرتبط إيجابيا مع كمية الأجسام المضادة في العينة .

4 ) إضافة الركيزة التلوين هذا الأسلوب يستخدم أساسا للكشف عن الأجسام المضادة الممرض لتشخيص الأمراض المعدية .

الأسلوب غير المباشر لديه ميزة أن نفس الانزيم المسمى الأجسام المضادة يمكن أن تستخدم للكشف عن الأجسام المضادة المقابلة طالما أن مستضد المغلفة هو تحويلها . مفتاح النجاح في الأسلوب غير المباشر هو نقاء المستضد . على الرغم من أن في بعض الأحيان يمكن الحصول على نتائج فعالة من خلال طلاء الخام استخراج مستضد ، ينبغي تنقيته قدر الإمكان لتحسين خصوصية الاختبار . وينبغي إيلاء اهتمام خاص إلى إزالة الشوائب التي يمكن أن تتفاعل مع مصل الإنسان العادي ، على سبيل المثال ، المؤتلف مستضد مع كولاي مثل الهندسة الانزيم ، إذا كان يحتوي على عنصر كولاي ، من المرجح أن تتفاعل مع الأجسام المضادة ضد كولاي في دم الشخص المصاب . المستضدات لا تحتوي على المواد التي تتفاعل مع انزيم المسمى المضادة IG الإنسان ، على سبيل المثال ، مستضدات من البلازما البشرية أو الأنسجة البشرية . وبالإضافة إلى ذلك ، إذا كان مستضد يحتوي على بروتين غير ذي صلة ، وسوف تؤثر أيضا على كفاءة التغليف بسبب المنافسة الامتزاز . تدخل آخر عامل في الأسلوب غير المباشر هو عدم التحديد من تركيزات عالية من مصل الدم العادي . المرضى الذين يعانون من المصل مفتش محددة تمثل سوى جزء صغير من مجموع مفتش . غير محددة يمكن أن كثف على مفتش مفتش الناقل الصلبة مباشرة ، وأحيانا على سطح مستضد المغلفة . ولذلك ، في الطريقة غير المباشرة ، مستضد المغلفة مع البروتينات غير ذات الصلة ( مثل مصل الألبومين البقري ) مرة أخرى ، من أجل سد الفجوة في المرحلة الصلبة . وبالإضافة إلى ذلك ، يجب أن تكون مخففة ( 1 : 40-1 : 200 ) في وقت مبكر من أجل تجنب الإفراط في السلبية الخلفية .

4 - اختبار الأجسام المضادة عن طريق المنافسة

الأجسام المضادة المحددة التي يمكن الكشف عنها باستخدام هذا الأسلوب عندما تدخل مادة في مادة مستضدي ليس من السهل إزالتها أو الحصول على ما يكفي من تنقية المستضد . المبدأ هو أن الأجسام المضادة في العينة و كمية معينة من الأجسام المضادة انزيم المسمى تتنافس مع المرحلة الصلبة مستضد ملزمة . أكثر الأجسام المضادة في العينة ، أقل من الأجسام المضادة انزيم المسمى ملزمة في المرحلة الصلبة ، وبالتالي فإن رد الفعل الإيجابي هو أخف من رد فعل سلبي . إذا كانت الأجسام المضادة عالية النقاء ، يمكن أن تكون مغلفة مباشرة في المرحلة الصلبة . إذا كان هناك تدخل المواد في المستضد ، فإنه ليس من السهل أن تكون مغلفة مباشرة بنجاح ، يمكن اعتماد طريقة محاصرة ، وهذا هو ، المغلفة مع الأجسام المضادة المقابلة الصلبة مستضد ، مستضد ، ثم تضاف إلى شكل صلب مستضد . غسل لإزالة الشوائب في المستضد ، ثم إضافة عينة انزيم المسمى الأجسام المضادة إلى المنافسة ملزمة فعل . هناك العديد من النماذج في الكشف عن الأجسام المضادة من قبل طريقة تنافسية ، والتي يمكن أن تجمع بين عينة انزيم المسمى الأجسام المضادة مع المرحلة الصلبة مستضد . نموذج آخر هو أن عينة مستضد جنبا إلى جنب مع إضافة إلى الأجسام المضادة في المرحلة الصلبة من أجل المنافسة ملزمة ، وغسلها ، ثم إضافة انزيم المسمى الأجسام المضادة للمستضد ، ملزمة في المرحلة الصلبة من ردود الفعل . هذه الطريقة تستخدم عادة في الكشف عن الاجسام المضادة .

5 - مقايسة المستضدات التنافسية

بسبب عدم وجود اثنين أو أكثر من المواقع التي يمكن استخدامها في ساندويتش الأسلوب ، لا يمكن الكشف عنها من قبل اثنين من الأجسام المضادة ساندويتش الأسلوب . المبدأ هو أن مستضد في العينة و كمية معينة من انزيم المسمى مستضد تتنافس مع الأجسام المضادة الصلبة ملزمة . أكثر كمية المستضد في العينة ، أقل انزيم المسمى مستضد ملزمة في المرحلة الصلبة ، أخف لون زوي . هذه الطريقة تستخدم عادة في الكشف عن جزيء صغير من الهرمونات والأدوية .

6 . التقاط الأجسام المضادة المغلفة

الكشف عن الغلوبولين المناعي الأجسام المضادة المستخدمة في التشخيص المبكر للأمراض المعدية . غير اليسا هو مناسبة فقط للكشف عن مجموع الأجسام المضادة أو مفتش الأجسام المضادة . على سبيل المثال ، إذا كانت الأجسام المضادة IgM تم الكشف عنها مباشرة من قبل طريقة غير مباشرة مستضد المغلف ، تركيز عال من الأجسام المضادة IgG موجودة عادة في العينة ، والتي يمكن أن تجعل بعض الأجسام المضادة IgM غير قادر على ربط المرحلة الصلبة من خلال الجمع بين تنافسية المرحلة الصلبة مستضد . ولذلك ، إذا كان استخدام الأجسام المضادة IgM المضادة البشرية مثل الأجسام المضادة IgM الثانية ، يجب أن تكون العينة الأولى تعامل مع البروتين أو الأجسام المضادة IgG ، من أجل القضاء على تدخل الفريق . في التجارب السريرية ، ونحن غالبا ما تستخدم طريقة محاصرة لتحديد الأجسام المضادة IgM . الأجسام المضادة الغلوبولين المناعي البشري أولا المغلفة مع المرحلة الصلبة لالتقاط الغلوبولين المناعي ( بما في ذلك الأجسام المضادة المحددة وغير المحددة الغلوبولين المناعي الأجسام المضادة ضد المستضدات في عينات مصل الدم ) . مستضد ثم تضاف إلى الجمع بين ذلك مع الغلوبولين المناعي محددة فقط . انزيم العلامات ثم تضاف إلى الأجسام المضادة المحددة ضد المستضد . ثم مع الركيزة ، اللون ، وهذا هو ، مع عينات من الغلوبولين المناعي ارتباطا إيجابيا . هذه الطريقة غالبا ما تستخدم في التشخيص المبكر للعدوى الفيروسية . الشكل 2-7 نمط الكشف عن الأجسام المضادة لفيروس التهاب الكبد A ( HAV ) . عامل الروماتويد ( RF ) يمكن أن تتداخل أيضا مع التقاط المغلف طريقة للكشف عن الغلوبولين المناعي الأجسام المضادة ، مما يؤدي إلى ردود فعل إيجابية كاذبة . ولذلك ، فإن الطريقة غير المباشرة تحييد مفتش هو شعبية جدا في الآونة الأخيرة ، وذلك باستخدام هذه الكواشف للكشف عن الأجسام المضادة IgM ضد الفيروس المضخم للخلايا و جوندياي التوكسوبلازما بنجاح .

abs-elisa إليسا ،

ABS هو اختصار الافيدين البيوتين النظام . الأفيدين هو بروتين سكري ، الوزن الجزيئي 60 ، 000 ، كل جزيء يتكون من أربعة مفارز ملزمة البيوتين . البيوتين هو مركب جزيئي صغير مع الوزن الجزيئي 244 . إن biotinylated المنتجات التي تم الحصول عليها من خلال طريقة كيميائية مشتقة succinimide هيدروكسي يمكن أن تشكل biotinylated المنتجات مع أنواع كثيرة من الجزيئات الكبيرة مثل البروتين والسكر . البيوتين هو أكثر حساسية من الأجسام المضادة للمستضد ، و تقارب البيوتين هو أكثر استقرارا . منذ واحد يمكن أن تكون مرتبطة مع أربعة البيوتين الأفيدين الجزيئات ، وتقاسم المنافع ، إليسا يمكن تقسيمها إلى نوعين : انزيم المسمى الأفيدين البيوتين ( مختبر ) و سد الأفيدين البيوتين ( ABC ) . على حد سواء ، biotinylated الأجسام المضادة ( أو مولدات المضادات ) كانت تستخدم لتحل محل الأجسام المضادة انزيم المسمى ( مولدات المضادات ) في proelisa النظام . في المختبر ، الصلبة البيوتين يتفاعل مع غير المسمى الأفيدين ، ثم إضافة انزيم المسمى البيوتين لزيادة الحساسية . في وقت مبكر ، الأفيدين المستخرجة من بياض البيض ، الذي هو بروتين سكري أساسي و كثف مع البوليسترين الناقل . streptavidin المستخرجة من متسلسلة ، ومع ذلك ، لا يوجد لديه مثل هذا العيب ، و لديه ميل إلى استبدال السابق في إليسا التطبيق . لأن abs-elisa يستخدم أكثر من اثنين من الكواشف من العام إليسا ، خطوات التشغيل المضافة ، وتطبيق abs-elisa في التجارب السريرية ليست كثيرة .