بعد الانتهاء من عزل وزراعة الخلايا الليفية الإنسان من سرطان المريء ، من الضروري إجراء مزيد من تحديد وتحليل وظيفي للتأكد من أن الخصائص البيولوجية من الخلايا الليفية الإنسان يتوافق مع متطلبات التجربة . وفيما يلي الخطوات العملية الرئيسية التالية :

1 - مراقبة مورفولوجيا الخلايا

- استخدام المجهر المقلوب لمراقبة مورفولوجيا الخلايا بشكل دوري . الخلايا الليفية الأولية عادة ما تكون مغزلي أو مضلع ، مع نمو الملتصقة ، السيتوبلازم تمتد بشكل جيد . إذا كان هناك جولة العائمة أو غير طبيعية تجمع الخلايا ، قد تشير إلى التلوث أو سوء حالة الخلية ، ثقافة الشرط يحتاج إلى إعادة تقييم .

2 - تحديد مناعي

- immunofluorescence تلطيخ مع علامات محددة ( مثل فيمنتين ، α - سما ) . الخلايا الليفية يجب أن تعبر عن vimentin عالية ، في حين أن معدل الإيجابية α - سما يمكن أن تعكس درجة التنشيط . ملاحظة وضع ضوابط مماثلة لاستبعاد غير محددة ملزمة .

3 . وظيفية اختبار التحقق

- اختبار القدرة على الانتشار : انتشار الخلايا تم تقييمها من قبل cck-8 أو ايدو طريقة مقارنة الفرق بين الخلايا الليفية السرطانية المجاورة و . . . . . . .

- تحليل إفراز الكولاجين : الكشف عن مستوى إفراز الكولاجين Ⅰ / Ⅲ بواسطة انزيم مرتبط المناعي فحص ( ELISA ) أو لطخة غربية ، وتحديد القدرة على تعزيز التليف .

- شارك في ثقافة التجربة : شارك في ثقافة الخلايا الليفية مع خطوط خلايا سرطان المريء ( على سبيل المثال ، kyse-150 ) لمراقبة تأثيرها على الغزو والهجرة من الخلايا السرطانية ( على سبيل المثال ، transwell التجربة ) .

4 - الحفظ بالتبريد والإنعاش

- اختيار لوغاريتمي مرحلة نمو الخلايا ، مع 10 ٪ DMSO تحتوي على سائل التخزين المجمد في أنبوب التخزين المجمد ، التبريد المبرمجة ثم تحويلها إلى النيتروجين السائل . عندما يتعافى ، حمام الماء يذوب بسرعة ، وتجميد السائل هو إزالتها بواسطة الطرد المركزي .

تحذيرات

- إجراء عمليات معقمة بدقة لتجنب التلوث بالمفطورات؛

- ينبغي ألا يتجاوز عدد مرات مرور الخلايا الأولية 5 أجيال لمنع الانجراف المظهري؛

- ينبغي تكرار التجارب الوظيفية أكثر من ثلاث مرات لضمان موثوقية البيانات .