في مجال الكشف عن الأجسام المضادة المناعية انزيم مرتبط المناعي ( ELISA ) مع خصوصية وحساسية عالية ، أصبح حجر الزاوية في التحليل الكمي من المؤشرات الحيوية مثل البروتينات والأجسام المضادة . ومع ذلك ، مجموعة ديناميكية ، وهو مؤشر مهم جدا ، غالبا ما يتم تجاهلها ، مباشرة يحدد موثوقية تطبيق النتائج التجريبية . فهم وتحسين المدى الديناميكي هو شرط مسبق لضمان فعالية إليسا البيانات .

ما هو النطاق الديناميكي إليسا ؟

دينامية مجموعة ( DRG ) يشير إلى مجموعة من اليسا التي يمكن أن تحدد بدقة تركيز الهدف analytes . . . . . . . وهذا هو ، في هذا النطاق ، مستقرة وموثوق بها نسبة العلاقة بين الكشف عن إشارة ( عادة ما يشير إلى قيمة التطوير التنظيمي الامتصاصية ) و الهدف analytes ' concentration ( عادة الخطية أو منحنى المناسب العلاقة ) . بعد هذا النطاق ، فإن النتائج الكمية تفقد الدقة :

* الحد الأدنى أدناه : كثافة إشارة منخفضة جدا ، لا يمكن تمييزها عن الضوضاء في الخلفية ( مثل ثقب فارغ الخلفية إشارة ) على نحو فعال ، مما أدى إلى سلبية كاذبة أو لا يمكن الكشف عنها .
* فوق الحد الأعلى : إشارة قد تصل إلى منصة الفترة لم تعد تنمو ( التشبع ) ، أو غير طبيعي " هوك " تأثير ( إشارة إلى انخفاض في تركيزات عالية بدلا من ذلك ) ، مما أدى إلى التقليل بشكل كبير من التركيز الفعلي .

وباختصار ، فإن المدى الديناميكي يحدد تركيز حدود " multiquality الطاقة " في إليسا .

كيفية حساب المدى الديناميكي والتعبير ؟

عادة ما يتم تحديد المدى الديناميكي من خلال بناء منحنى القياسية :

1. إعداد المعايير : إعداد سلسلة من التدرج مخففات ( على سبيل المثال ، 8 نقاط التركيز ) باستخدام الهدف analytes ( المعايير ) مع تركيزات معروفة .
2 . اختبار ورسم المنحنى : هذه المعايير جنبا إلى جنب مع عينات اختبار الاليزا ، قياس تركيز نقطة التطوير التنظيمي القيم .
3 . منحنى المناسب : تركيز ( س ، وعادة ما تأخذ لوغاريتمي ) مقابل قيمة التطوير التنظيمي ( ص ) منحنى المناسب ( عادة أربعة المعلمة الانحدار اللوجستي وغيرها من النماذج ) .
4 - تحديد المدى : الحد الأدنى من المدى الديناميكي هو عادة بأنها الحد الكمي ( LOQ ) ، أي في هذا التركيز ، دقة الكشف ( مثل السيرة الذاتية ≤ 20 ٪ ) ودقة ( معدل الاسترداد في 80 ٪ - 120 ٪ ) مقبولة ، إشارة أعلى بكثير من فارغة ( على سبيل المثال ، فارغة يعني + 10 مرات الانحراف المعياري ) . الحد الأعلى هو أعلى تركيز نقطة في المنحنى الذي يبقى مقبول الخطية أو تركيبها بشكل جيد و لا تشبع .
5 - التعبير : النتائج عادة ما تكون " 20 بيكوغرام / مل YY نانوغرام / مل " أو " عبر ض أوامر الحجم ( مثل 3 سجلات ) " . نطاق أوسع ، أقوى طريقة التطبيق .


لماذا مجموعة ديناميكية مهمة جدا ؟

1 . تجنب عينة تخفيف الخطأ : مجموعة ديناميكية مثالية ينبغي أن تغطي أكثر من المتوقع تركيز العينة المستهدفة . مجموعة ضيقة جدا ، قد تحتاج إلى إجراء العديد من التجارب على عينة من أجل استكشاف تخفيف متعددة . الإفراط في تخفيف ليس فقط يزيد من خطوات التشغيل والخطأ ، ولكن أيضا قد يؤدي إلى مصفوفة تأثير التدخل .
2 - ضمان موثوقية البيانات : فقط البيانات المقاسة في مجموعة ديناميكية يمكن أن يكون لها معنى كمي . دقة ودقة البيانات خارج النطاق ( وخاصة بالقرب من الحد الأدنى أو الحد الأعلى ) سوف تنخفض بشكل ملحوظ .
3 . تحسين كفاءة التجربة : مجموعة واسعة النطاق الديناميكي يقلل من الخطوات المعقدة لتحسين ظروف التخفيف ، وخاصة مناسبة لأنّ عينات مع اختلاف كبير في التركيز ( على سبيل المثال ، الأنسجة المختلفة المصدر ، مسار مختلف العينات ) .
4 - مقارنة النتائج : من المهم جدا أن تكون واضحة و التأكد من أن التحليل في نفس النطاق الديناميكي فعالة عند مقارنة البيانات من دفعات مختلفة من التجارب ، ومختبرات مختلفة أو مجموعات .

العوامل الرئيسية التي تؤثر على مجموعة ديناميكية إليسا

1 - تقارب وخصوصية الأجسام المضادة ضد الزوج :
* الأجسام المضادة عالية تقارب : يمكن تحسين الحساسية ( الحد الأدنى ) ، ولكن أيضا يمكن أن تصل إلى التشبع بسرعة أكبر ( الحد الأعلى ) .
* الاقتران اختيار الأجسام المضادة : مزيج من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ( خصوصية عالية ، ولكن مجموعة قد تكون ضيقة نسبيا ) و الأجسام المضادة بولكلونل ( قد توفر مجموعة أوسع ، ولكن مع إيلاء الاهتمام إلى خصوصية ) يمكن أن تؤثر على مجموعة من الاستراتيجيات . درجة الأجسام المضادة حاتمة التداخل أمر بالغ الأهمية أيضا .
2 . حساسية و قوة الإشارة من نظام الكشف :
* انزيم الركيزة النظام : هورس راديش پراكسيداز ( HRP ) والفوسفاتيز القلوية ( ALP ) هي الإنزيمات الأكثر استخداماً للتغيير . اختيار الركيزة ( على سبيل المثال ، TMB ، مكتب أمين المظالم ، تشيميلومينيسسينسي الركيزة ، الركيزة الفلورسنت ) لها تأثير كبير على قوة الإشارة و الخلفية . حساسية عالية الركيزة ( مثل حساسية عالية TMB أو تشيميلومينيسسينسي الركيزة ) يمكن أن تقلل بشكل فعال في الكشف عن الحد الأدنى .
* نظام مكبر للصوت إشارة : استخدام البيوتين streptavidin مثل نظام مكبر للصوت متعدد المراحل يمكن أن تحسن كثيرا من حساسية ، وتوسيع الحد الأدنى .
3 . نوعية تمييع القياسية : نقاء ، تركيز دقيق و مصفوفة من تمييع ( ينبغي أن تحاكي عينة مصفوفة ) تؤثر بشكل مباشر على نوعية ودينامية مجموعة من منحنى القياسية .
4 - مصفوفة الآثار : المكونات المعقدة في مصل الدم ، البلازما ، خلية ثقافة supernatants والأنسجة lysates قد تتداخل مع مستضد الضد ملزمة أو رد فعل الأنزيمية ، مما يؤدي إلى مجموعة ديناميكية فعالة في عينات مختلفة من منحنى القياسية ( غالبا ما تظهر مجموعة صغيرة ) .
5 - العملية التجريبية والأجهزة : دقة العينة ، الحضانة الوقت / درجة الحرارة ، دقة غسل لوحة ، أداء انزيم العلامات ( وخاصة انخفاض وارتفاع دقة القراءة odvalue odvalue ) سوف تؤثر على النتيجة النهائية و مجموعة ديناميكية .

استراتيجية التحسين وتقييم المدى الديناميكي

1 . اختيار أدوات ذكية : التحقق من التعليمات بعناية ، مقارنة مع مجموعة ديناميكية ، والحساسية ( اللد / LOQ ) من مختلف العلامات التجارية ، وما إذا كان أو لم يكن يطابق توقع تركيز العينة . يفضل مجموعة واسعة من المنتجات .
2 . precomprehensive precomprehensive : تجارب مع مختلف تخفيف مضاعفات ( على سبيل المثال : 1 : 10 ، 1 : 100 ، 1 : 1000 ) أجريت على عينات غير معروف مع التركيز ، لضمان أن معظم عينات التطوير التنظيمي القيم تقع في منتصف منحنى القياسية ( منطقة مثالية ) .
3 - التحقق من تأثير مصفوفة : تأثير مصفوفة على منحنى القياسية تم تقييمها باستخدام معيار معدل الاسترداد .
4 - تحسين الظروف التجريبية : على فرضية تلبية متطلبات الحساسية ، وتقصير وقت وضع اللون بشكل صحيح أو تقليل تركيز الأجسام المضادة انزيم المسمى قد تساعد على منع تركيز عال من العينات المشبعة قبل الأوان ، وبالتالي توسيع الحد الأعلى .
5. نعلق أهمية كبيرة على منحنى المناسب : اختيار النموذج الرياضي المناسب لتناسب منحنى القياسية أمر بالغ الأهمية ، لا سيما في الجزء غير الخطية . تأكد من أن البحث هو قيمة عالية و تركيب بقايا صغيرة .
6 - التركيز على الدقة : تقييم دقة ( السيرة الذاتية ) من تكرار التجارب في كلا طرفي المدى الديناميكي ( وخاصة بالقرب من loq ) للتأكد من أنها تلبي المتطلبات الكمية .

سادساً - اعتبارات هامة

* المدى الديناميكي = مجموعة خطية : المدى الخطي هو مجموعة ديناميكية من إشارة وتركيز العلاقة الخطية بين الفاصل الزمني ، عادة أقل من كامل النطاق الديناميكي . المدى الديناميكي يتكون من مجموعة خطية وغير خطية ، ولكن يمكن أن تناسب بدقة الجزء الكمي .
* مجموعة ديناميكية ≥ الكشف عن مجموعة : الكشف عن مجموعة في بعض الأحيان يشير إلى أداة ( على سبيل المثال ، انزيم العلامات الصك ) يمكن قراءة مجموعة من التطوير التنظيمي ( على سبيل المثال ، 0.000-4.000 التطوير التنظيمي ) ، أكبر بكثير من إليسا نفسها فعالة في نطاق كمي .
* هوك تأثير فخ : في ساندويتش إليسا ، تركيزات عالية من أكثر من غاو يمكن أن يؤدي إلى انخفاض في إشارة . إذا كانت قيمة المواد المستنفدة للأوزون منخفضة بشكل غير طبيعي دون تمييع ، وارتفاع تركيز العينة يجب أن يكون المشتبه به ، و تمييع اختبار ينبغي القيام به .


مجموعة ديناميكية من إليسا ليست بسيطة المعلمة التقنية ، بل هو جسر يربط التصميم التجريبي مع بيانات موثوق بها الانتاج . من المهم جدا أن نفهم تماما التعريف ، أهمية ، العوامل المؤثرة في استراتيجية التحسين من أجل دقة تصميم التجارب ، صحيح تفسير النتائج التجريبية ، وعلى نحو فعال مقارنة مختلف البيانات البحثية . عند اختيار عدة ، وتجهيز العينات وتحليل البيانات ، والحفاظ على المدى الديناميكي في الاعتبار هو ضمانة علمية للحصول على نتائج ناجحة وموثوق بها من إليسا البحث .